Предварительная обработка проб для ПЦР

ПЦР позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК, даже когда бессильны другие методы. Безусловно, ПЦР — мощный и эффективный диагностический инструмент, позволяющий быстро и точно найти возбудителей очень многих инфекций.

История

Полимеразная цепная реакция была открыта Кэри Маллис. Он был награжден Нобелевской премией по химии 1993 года под это открытие, через семь лет после того, как он и его коллеги из компании Cetus предложили его для практического использования. Впервые метод был изобретен в 1983 году, во время работы Маллис в компании Cetus в городе Емеривиль (Калифорния), одной из первых биотехнологических компаний. Его задачей было создание коротких цепочек ДНК для других ученых. Маллис писал, что идея ПЦР пришла ему, когда он ночью в своем автомобиле ехал вдоль Калифорнийского шоссе 1. Он продумывал новый путь анализа изменений (мутаций) в ДНК, когда осознал, что вместо этого он изобрел метод амплификации любого участка ДНК с помощью повторных циклов дублирования, которые осуществлял фермент ДНК-полимераза. В журнале Scientific American Маллис подвел подсумок метода: «Начиная с единой молекулы ДНК, носителя генетической информации, ПЦР может предоставить 100 000 000 000 подобных молекул за несколько часов. Реакцию очень легко провести, она требует одной тестовой трубки, незначительного количества реагентов, и источники тепла ».

Фермент ДНК-полимераза встречается естественно в живых организмах. В живых клетках он выполняет функции репликации ДНК в течение митоза и мейоза. Полимераза работает, связываясь с одной цепочкой ДНК и синтезируя другой, создавая двойную спираль. В первом прототипе процесса ПЦР, фермент использовался in vitro (в контролируемой окружении за пределами организма). Двухцепная молекула ДНК разделялась на отдельные цепочки с помощью нагрева до 94 ° C. Однако при этой температуре ДНК-полимераза, которая использовалась в то время, денатурувалася, поэтому фермент приходилось добавлять после стадии нагрева на каждом цикле реакции. Оригинальное процедура была очень неэффективна, так как требовала много времени, больших количеств ДНК-полимеразы, и непрерывного внимания в течение всего процесса.

Позже, этот оригинальный процесс ПЦР был значительно усовершенствован использованием ДНК-полимеразы, взятой из термофильных (теплолюбивых) бактерий, обычно растут в гейзерах при температуре выше 110 ° C. ДНК-полимераза, взятая из этих организмов, стойка при высоких температурах, и при использовании в ПЦР не повреждается при нагревании до необходимой температуры. С тех пор, как необходимость добавлять новую ДНК-полимеразы на каждом цикле исчезла, процесс копирования ДНК был упрощен и автоматизирован.

Одна из первых теплостойких ДНК-полимеразы была получена от бактерии Thermus aquaticus и стала известна под названием «Taq». Taq-полимераза широко используется для ПЦР и сейчас. Однако, ее недостатком является то, что из-за отсутствия механизма коррекции ошибок в 3 ‘→ 5’ направлении, она делает относительно большое количество ошибок при копировании ДНК, приводит к мутациям. Новые полимеразы, такие как Pwo или Pfu, полученные из архей, имеют такой механизм коррекции и могут значительно сократить число мутаций, которые встречаются в копируемых последовательности ДНК. Однако, эти ферменты полимеризуют ДНК гораздо медленнее, чем Taq. Сейчас доступны комбинации Taq и Pfu, обеспечивающих как высокую процесивнисть (протяженность участка, синтезируется за одно связывания фермента, и в результате скорость синтеза), так и высокую точность копирования ДНК.

ПЦР сейчас может выполняться на фрагментах ДНК размером более 10 kbp (тысяч пар оснований), но средний размер участка ДНК, амплифицируемого — от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований ДНК. Проблема с длинными фрагментами — в большом количестве ошибок и длинном времени реакции, поэтому необходимо поддерживать баланс между точностью и просесивнистю фермента. Обычно, чем дольше участок, тем выше вероятность ошибок.

Метод ПЦР был запатентован корпорацией Cetus, где работал Маллис, вскоре после его открытия. Использование Taq-полимеразы также было защищено патентами. Однако, произошло несколько высокопрофильных судебных процессов по этому методу, в частности неудачный судебный процесс, инициированный компанией DuPont. Фармацевтическая компания Hoffmann-La Roche приобрела права на патенты в 1992 году и сейчас имеет все права на ПЦР. Битва патентов на право использования фермента Taq-полимеразы все еще продолжается в нескольких юрисдикциях во всем мире между компаниями La Roche и Promega. Интересно, что компаниям удалось продлить права на ПЦР и Taq на время после окончания начального патента 28 марта 2005.

Правила сбора материала для исследования

Чтобы получить максимальной точный результат, забор биообразцов для ПЦР производят следующим образом:

  1. Инструментарий, контейнеры для изъятого материала должны быть продезинфицированы. А лучше использовать одноразовые приспособления.
  2. Собранные образцы крови нужно помещать в пробирки, которые содержат антикоагулянты. А в процессе забора обращаются к специальным вакуумным системам.
  3. Забор любого биоматериала нужно осуществлять в манипуляционном кабинете.

Для диагностики могут использовать различный материал: все будет зависеть от разновидности инфекции:

  • Мaзки/сoскобы из шейки матки/уретры, утренняя мoча: при тестировании на патологии, которые передаются половым путем.
  • Крoвь: при тестировaнии на TORCH-инфекции, ВИЧ, гепатит.
  • Спиннoмозговая жидкoсть: при подозрении на дефекты в работе центральной нервной системе.
  • Мазoк из горла/зева: при проверке на цитомегаловирус, мононуклеоз.
  • Мoкрота/плевральная жидкость: при инфицировании легких.
  • Образцы ткани плаценты: для исключения либо подтверждения внутриутробной инфекции.
Читайте также:  Всд симптомы у взрослых лечение народными средствами

Подготовка к исследованию

Анализ на ПЦР является самым быстрым и достоверным способом на ранних этапах обнаружить инфекцию, но бывают и ложноположительные/ложноотрицательные результаты.

Для сохранения нервной системы как своей, так и сотрудников медицинского учреждения, следует правильно подготовиться к исследованию.

Подготовка к ПЦР у мужчин

Перед исследованием ПЦР мужчинам следует помнить, чего делать нельзя:

Подготовка к исследованию
  • мочиться за 3 часа до исследования;
  • производить спринцевание и стерильную обработку члена;
  • мыть член мылом, содержащим антибиотик;
  • заниматься сексом за двое суток до ПЦР на ИППП;

Подготовка к ПЦР в гинекологии

Женщинам перед тем как сдать мазок на ПЦР запрещено:

  • при соскобе из уретры запрещено мочиться за 3 часа до исследования;
  • использовать вагинальные растворы с дезинфицирующими свойствами;
  • за двое суток до исследования применять суппозитории для влагалища;
  • использовать антибиотики местно, в том числе и мыло с антибиотиком;
  • занятия сексом за 48 часов до исследования;
  • применять антибиотик внутрь влагалища и уретры;
  • спринцеваться;
  • принимать антибиотики. После последнего приема антибактериального препарата должно пройти не менее 4 недель;
  • сдавать ПЦР во время менструации.

Когда нужно делать?

Когда следует бежать в лабораторию, чтобы проанализировать итоги вашего летнего отпуска? Специалисты советуют делать это в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов, дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений (цвет, количество, консистенция), случайный половой контакт без применения презерватива.

Безусловно, ПЦР — мощный и эффективный диагностический инструмент, позволяющий быстро и точно найти возбудителей очень многих инфекций. Чаще всего его используют для диагностики именно заболеваний, передающихся половым путем. Причём зачастую клиники и лаборатории уже предлагают своеобразные готовые «наборы» ПЦР на ИППП — 5 инфекций, 13 инфекций. В этих случая обычно материалом для исследования является мазок. Например, мазок на хламидии у женщин берут из влагалища, у мужчин — из уретры. Для анализа биоматериалом могут быть и слюна, и кровь, и моча, и выделения половых органов.

В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом. Лучше всего комбинировать различные методы исследования – помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА.

И помните: положительный ответ любого, даже самого современного лабораторного исследования – это повод не для паники, а для визита к врачу.

Общие положения

4.1 Организация и проведение испытаний и исследований с использованием метода ПЦР должны соответствовать требованиям настоящего стандарта, отвечать интересам потребителя, быть безопасными для жизни и здоровья населения и окружающей среды.

4.2 Для ПЦР-наборов должна быть предоставлена полная информация об их комплектации и дана полная характеристика каждого компонента ПЦР-набора.

4.3 ПЦР-наборы должны включать все необходимые реагенты, и их качество должно обеспечивать высокую чувствительность и специфичность системы амплификации. ПЦР-наборы должны обеспечивать воспроизводимость результатов амплификации для идентификации объекта тестирования.

4.4 ПЦР-наборы должны иметь документальное подтверждение указанным в их сопроводительной документации характеристикам.При использовании Тест-ПЦР-наборов для самостоятельного тестирования по каждому из них должна быть предоставлена полная информация о составе и метрологических характеристиках [1].

4.5 Проведение испытаний и исследований с помощью Тест-ПЦР-набора должно соответствовать требованиям по охране окружающей среды, установленным соответствующим Федеральным законом [2].

4.6 Требования настоящего стандарта распространяются на организации и предприятия независимо от их организационно-правовой формы.

4.7 Соответствие качеству и безопасности ПЦР-наборов подтверждается их производителем.

4.8 Не допускается использование ПЦР-наборов, не соответствующих требованиям настоящего стандарта.

Расшифровка результатов анализа

При соблюдении рекомендаций ошибки в результатах анализа методом ПЦР практически исключены. Подготовка результатов может занимать до 2 суток, однако в некоторых современных лабораториях анализы готовы уже в течение одного рабочего дня.

Читайте также:  Причины церебральной ишемии 1 степени у новорожденного

Результаты анализа ПЦР-12 могут быть положительными и отрицательными. Отрицательный результат свидетельствует о том, что инфекции не обнаружены. Положительный результат значит то, что в исследуемом материале присутствуют инфекционные элементы, и пациенту требуется качественное лечение. Также результат может быть положительным при носительстве инфекции, при этом проводить лечебные мероприятия нет необходимости. Какие инфекции входят в ПЦР-12 и могут быть примерами таких заболеваний? К ним относятся папилломавирусная инфекция, герпес и другие заболевания. Тем не менее важно знать, что человек, который является носителем, может заразить здоровых людей, даже если его самого данная болезнь не беспокоит.

Если в результате анализа присутствуют показатели с положительными значениями, необходимо обратиться к врачу для назначения эффективной терапии. Бывают ситуации, когда ПЦР показывает сомнительный результат, в таком случае следует сделать повторный анализ через 12-14 дней.

Кроме качественной характеристики, анализ ПЦР может иметь и количественную. С помощью количественной характеристики специалист может определить активность, стадию развития заболевания и выбирать наиболее подходящий для лечения препарат.

Полимеры

PEG и декстран являются полимерами, используемыми в качестве усилителей. PEG может усиливать амплификацию таким же образом, как органические растворители. Также, показано, что PEG снижает игнгибирование, вызванное фекалиями, и сульфатом декстрана, растительным полисахаридом. Кроме того, известно, что PEG имеет свойства стабилизации ферментов сравнимые с БСА, которые служат для поддержания ферментативной активности. Это действие может усилить амплификацию благодаря стабилизации ДНК полимеразы.

Берег жизни - медицинский портал о здоровье